Teknologi Plasmid

Oleh Rahayu Widyastuti

Kamis, 10 November 2016

Bagikan :

Tweet

Teknologi Plasmid

Plasmid – Molekul DNA berbentuk sirkuler yang terdapat dalam sel bakteri atau ragi. Plasmid juga dapat memperbanyak diri melalui proses replikasi sehingga dapat terjadi pengklonan DNA yang menghasilkan plasmid dalam jumlah banyak. Plasmid inilah yang berfungsi sebagai pembawa sifat rekombinan pada organisme yang akan direkayasa. Plasmid memilki ciri-ciri antara lain :

a.       berbentuk lingkaran tertutup dan untaiannya ganda (double stranded)

b.      dapat melakukan replikasi sendiri di luar kromosom inti

c.       terdapat di luar kromosom

d.      secara genetik dapat ditransfer secara stabil

Karena sifat-sifat plasmid yang menguntungkan, maka plasmid digunakan sebagai vektor atau pembawa gen untuk memasukkan gen ke dalam sel target. Contoh aplikasi penggunaan teknologi plasmid yang telah dikembangkan manusia adalah produksi insulin secara besar-besaran.

Agar dapat digunakan sebagai vektor, plasmid harus memiliki syarat-syarat diantaranya sebagai berikut :

1.    ukurannya relatif kecil dibanding dengan pori dinding sel inangnya

2.  mempunyai sekurang-kurangnya 2 gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang

3.  mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA asing

4.    memiliki titik awal replikasi sehingga dapat melakukan replikasi dalam sel inang

 Menurut tujuan penggunaannya, plasmid dibedakan menjadi 2 yaitu :

1.      plasmid untuk kloning prokariot, sebagai contoh adalah plasmid pUC 19 dan pBR 322

2.      plasmid yang digunakan untuk kloning eukariot yang digunakan adalah plasmid Ti.

Untuk memotong plasmid digunakan enzim restriksi. Enzim restriksi adalah enzim yangdigunakan untuk memotong DNA secara spesifik. Enzim restriksi disebut sebagai gunting biologi. Enzim ini diisolasi dari bakteri. Restriksi yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing agar urutan basanya bisa sesuai sehingga antara plasmid dan DNA asing yang disisipkan bisa  bersatu. Prinsip kerja enzim restriksi adalah:

1. Enzim restriksi yang digunakan adalah enzim endonuklease restriksi. Enzim pemotong ini mengenali DNA pada situs kusus dan memotong pada situs tersebut

2.  Situs pengenalan enzim restriksi adalah daerah yang simetri dengan poliandrom, artinya bila kedua utas DNA tersebut masing-masing dibaca dengan arah yang sama akan memberikan urutan yang sama pula nukleotidanya

3.   Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung kohesif (sticky end) dan ujung rata (blunt end).

Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi untuk menyambung dua ujung potongan DNA. Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA ligase dari E. Coli dan DNA ligase dari Fage T4. Prinsip kerja enzim ligase sebagai berikut:

1.     Enzim ligase menyambung dua ujung DNA yang semulanya terpotong

2.   penyambungan dilakukan dengan cara menyambung 2 ujung DNA melalui ikatan kovalen antara ujung 3’OH dari utas satu dengan ujung 5’P dari utas yang lain

3.  Penggunaan ligasi DNA ini mengkatalis ikatan fosfodiester antara kedua ujung DNA sehingga kedua fragmen DNA yang berupa potongan bisa bersatu menjadi satu.

Gen manusia dan plasmid yang telah menyatu membentuk lingkaran plasmid

ini disebut kimera (DNA rekombinan). 

Kimera tersebut kemudian dimasukkan ke dalam sel target E. coli. Bakteri ini akan hidup normal dan memiliki tambahan yang sesuai dengan sifat gen yang disisipkan. Bakteri E. coli kemudian di kultur untuk dikembangbiakkan. Bakteri tersebut kemudian mampu menghasilkan hormon insulin manusia.

Hormon insulin ini akhirnya dapat dipanen untuk digunakan oleh orang yang membutuhkannya. Keuntungan dari insulin hasil rekayasa genetik ini adalah insulin tersebut bebas dari protein hewan yang tercemar yang sering menimbulkan alergi. 

Tag : Enzim ligase, Plasmid Enzim restrisksi